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Hello小伙伴们世界好，我是生信技巧树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第八期。第七期咱们使用AddModuleScore_UCell函数诡计细胞的增殖和迁徙评分。本期，咱们将使用monocle2进行拟时序分析。

1.配景先容

系列推文前七期，咱们共同学习了单细胞测序的基础分析，从第八期开动，咱们将连接学习拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis），“Copykat”分析及细胞通信等高均分析。

疾病是一个动态变化的过程，在疾病发生发展的过程中，细胞情景随时间不休变化。现存的单细胞测序时刻提供的是某一时刻的“快照”，可是通过拟时序分析，咱们不错推断出细胞的动态变化过程。

拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）的界说如下：

拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）是一种分析方法，常常用于商议那些在时间上不纠合的数据集。它试图通过模拟时间序列的式样来分析数据，即使数据本人并不是按照时间限定集合的。这种分析方法在多个限制王人有应用，比如在生物信息学中，它不错用于分析基因抒发数据，即使这些数据不是在纠合的时间点上集合的。拟时序分析的要道在于构建一个编造的时间轴，然后在这个时间轴上对数据进行排序和分析。这常常触及到以下几个设施：数据预处置：清洗数据，确保数据的质料和一致性。特征接纳：识别和接纳对分析灵验的特征或变量。时间轴构建：确认数据的特质构建一个编造的时间轴，这可能基于生物学过程、本质联想或其他逻辑。排序：将数据按照编造时间轴进行排序。分析：使用时间序列分析的方法来分析排序后的数据，比如趋势分析、周期性分析等。考证：通过交叉考证或其他方法来考证分析效果的可靠性。*

单细胞拟时序分析的主要缱绻包括：

细胞发展轨迹推断：通过分析细胞情景的变化，推断细胞是如何从一种情景发展或分化到另一种情景。细胞情景排序：将细胞按照它们在假设的发展轨迹上的位置进行排序，即使这些细胞并非在纠合的时间点上被不雅测。生物学过程深入：识别细胞在特定生物学过程中的动态变化，如细胞分化、发育、疾病发达等。要道基因和调控集合识别：发当今细胞情景变调中起要道作用的基因和调控集合。细胞异质性沟通：揭示细胞群体里面的异质性，以及不同细胞亚群之间的关系。细胞气运展望：基于现时的细胞情景和拟时序轨迹，展望细胞可能的改日发展和分化气运。动态生物学过程建模：构建数学模子来模拟细胞情景的动态变化，为生物学假设提供定量形色。疾病商议和诊疗靶点发现：在疾病商议中，拟时序分析不错匡助深入病理情景下细胞的变化，发现潜在的诊疗靶点。发育过程的细胞谱系构建：在发育生物学中，拟时序分析有助于构建细胞谱系树，深入细胞的发源温和运。本质联想换取：通过深入细胞情景的变化，不错换取改日的本质联想，举例接纳哪些细胞情景进行进一步的本质考证。

Monocle是咫尺最常用的拟时序分析算法，其中枢时刻是一种机器学习算法——反向图形镶嵌(Reversed Graph Embedding)进行降维分析。Monocle2使用DDRtree进行降维分析，而Monocle3则使用UMAP降维，可视化细胞转录特征雷同性关系，从而形色细胞情景过渡轨迹。细胞情景过渡轨迹是“根”到“叶”的树状结构，细胞从根到达分支后，会接纳一个分支往辽阔转移，终末到达叶子，每个细胞的psudotime值是它从叶复返根的距离。

monocle的分析经由与seurat访佛，准备输入文献，创建monocle对象cds(new cell data set)，对数据预处置，筛选特定基因，降维，诡计psudotime值，终末可视化。本期使用monocle2进行拟时序分析。

2.数据分析2.1 导入数据

破除系统环境变量，确立职责目次，加载R包，接纳作念拟时序的亚群，读取恶性上皮细胞RDS文献：

rm(list=ls())getwd()setwd('')library(tidyverse)library(tinyarray)library(data.table) library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)library(monocle)sce.all = readRDS('malignant.rds')sce = sce.alltable(sce$celltype)Idents(sce) = sce$celltype

要是用我方电脑，细胞量太大，不错每个细胞亚群抽样 ：

allCells=names(Idents(sce))allType = levels(Idents(sce))# choose_Cells = unlist(lapply(allType， function(x){#   cgCells = allCells[Idents(sce)== x ]#   cg=sample(cgCells，10)#   cg# }))# cg_sce = sce[， allCells %in% choose_Cells]cg_sce = scetable(Idents(cg_sce))

2.2 数据准备

monocle构建CDS需要3个矩阵：

expr.matrixphenodata（pd）featuredata（fd）

expr.matrix：

Mono_tj<-cg_sceMono_matrix<-as(as.matrix(GetAssayData(Mono_tj，slot = "counts"))， 'sparseMatrix')

构建featuredata:

一般需要两个col，一个是gene_id，一个是gene_short_name，row对应counts的rownames：

feature_ann<-data.frame(gene_id=rownames(Mono_matrix)，gene_short_name=rownames(Mono_matrix))rownames(feature_ann)<-rownames(Mono_matrix)Mono_fd<-new("AnnotatedDataFrame"， data = feature_ann)

构建phenodata：品色堂永远免费

Seurat object中的@meta.data一般会存放表型议论的信息如cluster、sample的起头、group等，是以接纳将metadata变调为phenodata：

sample_ann<-Mono_tj@meta.datarownames(sample_ann)<-colnames(Mono_matrix)Mono_pd<-new("AnnotatedDataFrame"， data =sample_ann)

2.3 monocle分析经由

构建new cell data set：

Mono.cds<-newCellDataSet(Mono_matrix，phenoData =Mono_pd，featureData =Mono_fd，expressionFamily=negbinomial.size())

newCellDataSet函数中，expressionFamily参数用于指定抒发矩阵的数据类型，有几个选项不错接纳：寥落矩阵用negbinomial.size()；FPKM值用tobit()；logFPKM值用gaussianff()。

搜检phenodata、featuredata：

偷派自拍

head(pData(Mono.cds))head(fData(Mono.cds))

Mono.cds超越于Seurat V5构建的Seurat对象，随后需要对数据预处置（揣测圭臬因子、揣测糟塌度）：

Mono.cds <- estimateSizeFactors(Mono.cds)Mono.cds <- estimateDispersions(Mono.cds)

筛选基因，这里不错确认我方的需要筛选特定的基因：

disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)unsup_clustering_genes <- subset(disp_table， mean_expression >= 0.1)Mono.cds <- setOrderingFilter(Mono.cds， unsup_clustering_genes$gene_id)

用DDRtree进行降维分析：

Mono.cds <- reduceDimension(  Mono.cds，  max_components = 2，  method = 'DDRTree')

诡计psudotime值：

Mono.cds <- orderCells(Mono.cds)head(pData(Mono.cds))

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2.4 monocle可视化

展示State轨迹散布图：

plot_cell_trajectory(Mono.cds，cell_size = 1)

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展示Cluster/Pseudotime轨迹散布图：

p1 = plot_cell_trajectory(Mono.cds，color_by="celltype"， size=1，show_backbone=TRUE)p2 = plot_cell_trajectory(Mono.cds，color_by="Pseudotime"， size=1，show_backbone=TRUE) p1+p2

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分面浮现：

plot_cell_trajectory(Mono.cds， color_by = "celltype") + facet_wrap("~sample"， nrow = 1)

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树形图：

plot_complex_cell_trajectory(Mono.cds，x=1，y=2，color_by="celltype")+  scale_color_manual(values =mycolors)+  theme(legend.title = element_blank())

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沿时间轴的细胞密度图：

library(ggpubr)df <- pData(Mono.cds)view(df)

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ggplot(df，aes(Pseudotime， colour = celltype， fill=celltype))+        geom_density(bw=0.5，size=1，alpha =0.5)+theme_classic2()

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Monocle基因可视化：

head(unsup_clustering_genes)s.genes <- c("NOC2L"，"PLEKHN1"，"HES4"，"ISG15")p1 <- plot_genes_jitter(Mono.cds[s.genes，]，                        grouping = "State"， color_by = "State")p2 <- plot_genes_violin(Mono.cds[s.genes，]，                        grouping = "State"， color_by = "State")p3 <- plot_genes_in_pseudotime(Mono.cds[s.genes，]， color_by = "State")

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拟时议论基因聚类热图：

#高变基因disp.genes <- subset(disp_table， mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)diff_test <- differentialGeneTest(Mono.cds[disp.genes，]， cores = 4，                                   fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test， qval < 1e-50))plot_pseudotime_heatmap(Mono.cds[sig_gene_names，]， num_clusters=4，                             show_rownames=T， return_heatmap=T)

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2.5 BEAM分析

由于细胞基因抒发式样不同，单细胞轨迹中常常包括分支。通过BEAM(Branched expression analysis modeling)分析，咱们可找到以依赖于分支的式样调控的基因。

disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)disp.genes <- subset(disp_table， mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)mycds_sub <- Mono.cds[disp.genes，]plot_cell_trajectory(mycds_sub， color_by = "State")beam_res <- BEAM(mycds_sub， branch_point = 1， progenitor_method = "duplicate")beam_res <- beam_res[order(beam_res$qval)，]beam_res <- beam_res[，c("gene_short_name"， "pval"， "qval")]mycds_sub_beam <- mycds_sub[row.names(subset(beam_res， qval < 1e-4))，]plot_genes_branched_heatmap(mycds_sub_beam，  branch_point = 1， num_clusters = 3， show_rownames = T)

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结语

本期，咱们插足了单细胞高均分析系列，使用monocle2进行了拟时序分析。下一期，确认课程安排，咱们将暂时回到Bulk转录组，行使TCGA-STAD数据进行糊口分析。干货满满，接待世界抓续追更，谢谢！

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