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绪言

Hello小伙伴们人人好，我是生信手段树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第十期。第九期咱们用TCGA-STAD数据进行生计分析。本期，咱们将回到高档分析（CopyKAT分析），通过计较CNV评估上皮细胞良恶性。

1.布景先容

在第六期推文中，咱们聚会TCGA-STAD数据给上皮添加了恶性评分，从而协助分裂肿瘤细胞与非肿瘤细胞。在高档分析中，咱们不错应用inferCNV和CopyKAT对单细胞进行CNV(Copy number variation， 拷贝数变异)分析，分裂肿瘤细胞与非肿瘤细胞。

CNV是基因组结构变异(Structural variation，SV)的热切构成部分，主要原因是基因组发生重排，一般指长度为1kb以上的基因组大片断的拷贝数加多能够减少，主要透露为亚显微水平的缺构怨交流。CNV在肿瘤的发生和发展究诘中上演热切的变装。

本期咱们使用CopyKAT (Copynumber Karyotyping of Tumors)进行CNV分析，它是一种集成贝叶斯分割体式。应用scRNA-seq数据料到东谈主类肿瘤的基因组拷贝数，然后通过对拷贝数数据进行分层聚类，以识别非整倍体肿瘤细胞和二倍体基质细胞之间的最大距离。其旨趣相通是通过单细胞转录组数据来料到细胞的染色体倍数，进而料到是泛泛细胞（diploid）如故肿瘤细胞（aneuploid）。

2.数据分析2.1 导入数据

最初断根系统环境变量，加载R包，开拓新文献夹和使命目次，导入恶性上皮细胞数据：

rm(list=ls())options(stringsAsFactors = F)library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)library(infercnv)library(copykat)library(tidyverse)#devtools::install_github("broadinstitute/infercnv")dir.create("8-CNV")getwd()setwd("../8-CNV") sce=readRDS( "../6-TCGA_STAD/malignant.rds")table(sce$celltype)Idents(sce) = sce$celltype

幸免背面历程脱手的太长了对细胞进行抽样：

seurat_object = sceseurat_object <- subset(seurat_object， downsample=200)table(Idents(seurat_object))

瞻望肿瘤/泛泛细胞气象的基答允趣辱骂整倍体在东谈主类癌症中很常见 (90%)。具有泛泛全基因组拷贝数畸变（非整倍体）的细胞被以为是肿瘤细胞，而基质泛泛细胞和免疫细胞经常具有2N二倍体或接近二倍体的拷贝数溜达。copykat通过单细胞转录组数据来料到细胞的染色体倍数，进而料到是泛泛细胞（diploid）如故肿瘤细胞（aneuploid）。它还不错进一步对肿瘤细胞进行聚类，找出不同的亚群。

脱手CopyKAT

ngene.chr参数是过滤细胞的一个尺度，它条款被用来作念CNV瞻望的细胞，一个染色体上至少有5个基因。

sam.name界说样真称号 (sample name)，会给出来的文献加前缀

scRNA <- seurat_objectcounts <- as.matrix(scRNA@assays$RNA$counts)table(scRNA$celltype)if(T){cnv <- copykat(rawmat=counts， ngene.chr=5， sam.name="test"， n.cores=8)      saveRDS(cnv， "cnv.rds")}

添加CopyKAT恶果到seurat对象meta.data信息中：26uuu电影

cnv=readRDS( "cnv.rds")table(rownames(cnv$CNAmat))a = cnv$prediction$copykat.predtable(a)scRNA$CopyKAT = a

CopyKAT恶果可视化：泛泛细胞（diploid，蓝色）如故肿瘤细胞（aneuploid，红色）

p1 <- DimPlot(scRNA， group.by = "celltype"， label = T，reduction = 'tsne')p2 <- DimPlot(scRNA， group.by = "CopyKAT"，reduction = 'tsne') + scale_color_manual(values = c("#F8766D"，'#02BFC4'， "gray"))pc <- p1 + p2pc

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可视化maker基因'TPPP3'，'KRT17'的抒发情况，搜检CopyKAT恶果准确性：

cols = c("gray"， "coral2")plot <- FeaturePlot(scRNA， features = c('TPPP3'，'KRT17')，cols = cols， pt.size = 1，reduction = 'tsne')+    theme(panel.border = element_rect(fill=NA，color="black"， size=1， linetype="solid"))#加边框 plot_grid(p2，plot)

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CopyKAT恶果主要有两个：

1）瞻望的恶果泛泛细胞（diploid）如故肿瘤细胞（aneuploid）；

2） 每个CNV segment在每个细胞的抒发量。这里看出和inferCNV的不同来了，是基于genomic coordinate而不是gene level的抒发量。

绘图热图

copykat.test = cnvpred.test <- data.frame(copykat.test$prediction)CNA.test <- data.frame(copykat.test$CNAmat)head(pred.test)head(CNA.test[，1:5])my_palette <- colorRampPalette(rev(RColorBrewer::brewer.pal(n = 3， name = "RdBu")))(n = 999)chr <- as.numeric(CNA.test$chrom) %% 2+1rbPal1 <- colorRampPalette(c('black'，'grey'))CHR <- rbPal1(2)[as.numeric(chr)]chr1 <- cbind(CHR，CHR)rbPal5 <- colorRampPalette(RColorBrewer::brewer.pal(n = 8， name = "Dark2")[2:1])com.preN <- pred.test$copykat.predpred <- rbPal5(2)[as.numeric(factor(com.preN))]cells <- rbind(pred，pred)col_breaks = c(seq(-1，-0.4，length=50)，seq(-0.4，-0.2，length=150)，seq(-0.2，0.2，length=600)，seq(0.2，0.4，length=150)，seq(0.4， 1，length=50))heatmap.3(t(CNA.test[，4:ncol(CNA.test)])，dendrogram="r"， distfun = function(x) parallelDist::parDist(x，threads =4， method = "euclidean")，           hclustfun = function(x) hclust(x， method="ward.D2")，          ColSideColors=chr1，Colv=NA， Rowv=TRUE，          notecol="black"，col=my_palette，breaks=col_breaks， key=TRUE，          keysize=1， density.info="none"， trace="none"，          cexRow=0.1，cexCol=0.1，cex.main=1，cex.lab=0.1，          symm=F，symkey=F，symbreaks=T，cex=1， cex.main=4， margins=c(10，10))legend("topright"， paste("pred."，names(table(com.preN))，sep="")， pch=15，col=RColorBrewer::brewer.pal(n = 8， name = "Dark2")[2:1]， cex=0.6， bty="n")

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再对肿瘤细胞再聚类并画热图，又能分红两群。

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table(pred.test$copykat.pred)tumor.cells <- pred.test$cell.names[which(pred.test$copykat.pred=="aneuploid")]colnames(CNA.test) <- gsub(".1$"， "-1"， colnames(CNA.test))tumor.mat <- CNA.test[， colnames(CNA.test) %in% tumor.cells]hcc <- hclust(parallelDist::parDist(t(tumor.mat)，threads =4， method = "euclidean")， method = "ward.D2")hc.umap <- cutree(hcc，2)rbPal6 <- colorRampPalette(RColorBrewer::brewer.pal(n = 8， name = "Dark2")[3:4])subpop <- rbPal6(2)[as.numeric(factor(hc.umap))]cells <- rbind(subpop，subpop)heatmap.3(t(tumor.mat)，dendrogram="r"， distfun = function(x) parallelDist::parDist(x，threads =4， method = "euclidean")，           hclustfun = function(x) hclust(x， method="ward.D2")，          ColSideColors=chr1，RowSideColors=cells，Colv=NA， Rowv=TRUE，          notecol="black"，col=my_palette，breaks=col_breaks， key=TRUE，          keysize=1， density.info="none"， trace="none"，          cexRow=0.1，cexCol=0.1，cex.main=1，cex.lab=0.1，          symm=F，symkey=F，symbreaks=T，cex=1， cex.main=4， margins=c(10，10))legend("topright"， c("c1"，"c2")， pch=15，col=RColorBrewer::brewer.pal(n = 8， name = "Dark2")[3:4]， cex=0.9， bty='n')

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终末把CNV的恶果投射到单细胞聚类恶果上看一看是否合理，Seurat尺度历程走一遍，聚类恶果和copyKAT分群恶果投射到TSNE上。

standard10X = function(dat，nPCs=50，res=1.0，verbose=FALSE){  srat = CreateSeuratObject(dat)  srat = NormalizeData(srat，verbose=verbose)  srat = ScaleData(srat，verbose=verbose)  srat = FindVariableFeatures(srat，verbose=verbose)  srat = RunPCA(srat，verbose=verbose)  srat = RunTSNE(srat，dims=seq(nPCs)，verbose=verbose)  srat = FindNeighbors(srat，dims=seq(nPCs)，verbose=verbose)  srat = FindClusters(srat，res=res，verbose=verbose)  return(srat)}GC1 <- standard10X(counts， nPCs=30， res=0.8)GC1$copykat.pred <- pred.test$copykat.predGC1$copykat.tumor.pred <- rep("normal"， nrow(GC1@meta.data))table(hc.umap)GC1$copykat.tumor.pred[rownames(GC1@meta.data) %in% names(hc.umap[hc.umap==1])] <- "tumor cluster 1"GC1$copykat.tumor.pred[rownames(GC1@meta.data) %in% names(hc.umap[hc.umap==2])] <- "tumor cluster 2"p1 <- DimPlot(GC1， label = T)p2 <- DimPlot(GC1， group.by = "copykat.pred")p3 <- DimPlot(GC1， group.by = "copykat.tumor.pred")p1 + p2 + p3

不错看到：2，4，8群是肿瘤细胞亚克隆

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从免疫细胞和肿瘤细胞的标记基因抒发来看，copyKAT不错正确找出泛泛细胞和肿瘤细胞。

FeaturePlot(GC1，features=c("PTPRC"， "EPCAM")， order = T)

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结语

本期，咱们使用CopyKAT分析评估上皮细胞良恶性。下一期，咱们将对T细胞亚群进行细分。趁机提前预报一下，胃癌系列推文完成后，将开启肺腺癌单细胞数据集GSE189357复现系列，有关视频也曾在B站上线：

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文献推文详见（单细胞测序+空间转录组描摹从癌前病变到浸润性肺腺癌的动态演变  ）。此外，对于推文施行的擢升和优化，宽容人人提妥当成见。谢谢！

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